DNA

Prof. Dr. A. Klein



Forschungsschwerpunkte
und einführende Veröffentlichungen

1. Regulation der Genexpression von Hydrogenasegenen in Methanococcus voltae
Noll I, Müller, S and Klein A (1999) Transcriptional Regulation of Genes Encoding the Selenium-Free
[NiFe]-Hydrogenases in the Archaeon Methanococcus voltae Involves Positive and Negative
Control Elements. Genetics 152(4):1335-1341

2. Makronukleus-Entwicklung und Transkriptionsaktivität des Ciliaten Euplotes crassus
Bender J, Klein A (1999) The telomere binding protein of Euplotes crassus prevents non-specific
transcription initiation but has no role in positioning transcription initiation complexes. Nucl. Acids Res.
Vol. 25, No. 14 2877-2882




Detaillierte Beschreibung der Forschungsschwerpunkte

1. Regulation der Genexpression von Hydrogenasegenen in Methanococcus voltae

M. voltae besitzt Gene für vier [NiFe]-Hydrogenasen. Diese Enzyme dienen der Gewinnung von Reduktionsäqivalenten für die Reduktion von C1-Körpern. Durch die so erfolgende Bildung von Methan gewinnt das Archaeon seine Energie. Zwei dieser Enzyme enthalten Selenocystein im aktiven Zentrum. Die beiden anderen haben an den entsprechenden Stellen Cysteinreste. Die Gegruppen für die selenfreien Hydrogenasen, frc und vhc werden nur in Abwesenheit von Selen transkribiert. Die Regulation dieser Transkription wird untersucht. Sie ist positiv und negativ. Ein Aktivatorprotein ist gereinigt worden, das präferentiell an die vhc-proximale Stelle bindet und wahrscheinlich die Bildung eines Aktivatorkomplexes an der frc-proximalen Bindungsstelle begünstigt.


Regulationsschema

Positive und negative Regulation der vhc- und frc-Transkriptionseinheiten. Die Promotoren sind dunkelgrün, die negativ regulatorischen cis-Elemente rot und die Aktivatorbindungsstellen hellgrün dargestellt. Pfeile geben negative und positive regulatorische Wirkungen wieder.


In einer Untergruppe der Archaea, zu der auch die Methanogenen gehören, wird die DNA durch Histone verpackt. Die Histone bilden Nukleosomen. In Methanococcus voltae haben wir drei Gene für ein histonähnliches Protein und zwei Histone gefunden. Durch Einführen von Deletionen werden wir ihre Rolle insbesondere auch bei der Genregulation untersuchen. Diese Arbeiten werden zusammen mit dem Labor von John Reeve an der Ohio State University in Columbus, Ohio durchgeführt. Außerdem versuchen wir, die Struktur der intergenen Region so zu verändern, daß die Wechselwirkung der regulatorischen Elemente sterisch erschwert wird, um die Auswirkungen solcher Veränderungen zu beobachten.


   

Auswirkung von Mutationen auf die Krümmung der intergenen Region. Die Abbildung zeigt links die vorhergesagte Krümmung der intergenen Region und rechts daneben die zweier Mutanten im Bereich zwischen den Aktivatorbindungsstellen (hier rot und grün gekennzeichnet).


2. Genomumlagerung, Promotoranalysen und postkonjugative Genexpression beim Ciliaten Euplotes crassus

Ciliaten zeichnen sich durch ihren heterokaryoten Kernzustand aus. Das bedeutet, daß jede Zelle einen generativen, transkriptionsinaktiven Mikronukleus und einen somatischen, transkriptionsaktiven Makronukleus besitzt. Die genetische Organisation dieser Makronuklei bei hypotrichen Ciliaten ist sehr ungewöhnlich. So gibt es pro Kern mehrere Millionen kurze Chromosomen, von denen jedes nur ein Gen trägt. Jedes Gen und damit auch jedes Chromosom wird durch bis zu eine Million Kopien repräsentiert. Dieser Zustand ist das Ergebnis einer dramatischen DNA-Umorganisation nach der Konjugation (sexuelle Phase). Der jeweils alte Makronukleus geht langsam zugrunde, während ein neuer aus einem Vorläuferkern gebildet wird. Bei der damit einhergehenden Genomumlagerung kommt es zur Polytänisierung, Fragmentierung, teilweisen Eliminierung und differentiellen Amplifizierung der DNA in der Anlage des neuen Makronukleus.


Konjugationspaar Zelle mit Mikro- und Makronukleus
Zellen von Euplotes crassus. Bild links: Zellen bei der Konjugation, nach der die Entwicklung neuer Makronuklei eingeleitet wird; rechts: Zelle mit dem kleinen kugelförmigen Mikro- und dem großen wurstförmigen Makronukleus.
Er enthält aufgrund der Genamplifikation mehr DNA, hat aber geringere Sequenzkomplexität.


In unserer Arbeitsgruppe wurde eine Methode zur Transformation dieses Organismus entwickelt, die auf der Herstellung artifizieller Makronukleuschromosomen beruht. Damit ist es möglich, die sehr kurzen Promotorregionen des Organismus, die in der Regel keine TATA-Box aufweisen, nicht nur in vitro sondern auch in vivo mit Hilfe von Reportergenen zu analysieren.

Weiterhin beschäftigen wir uns mit den Vorgängen nach Konjugation. Uns interessieren die an der Neustrukurierung des Genoms beteiligten Proteine, die durch zweidimensionale Gelektrophorese untersucht werden. Zur Analyse der Genexpression im alten Makronukleus nach der Konjugation wurden Chromosomen konstruiert, die das Gen für das grün fluoreszierende Protein (EGFP) als Reportergen tragen, dessen Expression zu verschiedenen Zeitpunkten der Makronukleusentwicklung induzierbar ist.


Expression von EGFP in einem lebenden Ciliaten. Phasenkontrast- (links) und fluoreszensmikroskopische (rechts) Aufnahme.



Neuere Veröffentlichungen zu den Forschungsschwerpunkten

1.

Berghöfer, Y., Agha-Amiri, K., and Klein, A. (1994) Selenium is involved in the negative regulation of the expression of selenium-free [NiFe] hydrogenases in Methanococcus voltae. Mol. Gen. Genet. 242:369-373.

Beneke, S., Bestgen, H. and Klein, A. (1995) Use of the Escherichia coli uidA gene as a reporter in Methanococcus voltae for the analysis of the regulatory function of the intergenic region between the operons encoding selenium-free hydrogenases. Mol. Gen. Genet. 248:225-228.

Noll, I., Müller., S. and Klein, A. (1999) Transcriptional Regulation of Genes Encoding the Selenium-Free [NiFe]-Hydrogenases in the Archaeon Methanococcus voltae Involves Positive and Negative Control Elements. Genetics 152(4):1335-1341.

2.

Dönhoff, T. and Klein, A. (1996) Timing of differential amplification of macronucleus-destined sequences during macronuclear development in the hypotrichous ciliate Euplotes crassus. Chromosoma 105:172-179.

Florian, V. and Klein, A. (1996) A nascent micronuclear pseudogene in the ciliate Euplotes crassus. Nucl. Acids. Res. 24:3195-3200.

Bender, J. and Klein, A. (1997) The telomere binding protein of Euplotes crassus prevents nonspecific transcription initiation but has no role in positioning transcription initiation complexes, Nucl. Acids. Res. 25:2877-2882.

Bender, J., Kämpfer, M. and Klein, A. (1999) Faithful expression of a heterologous gene carried on an artificial macronuclear chromosome in Euplotes crassus, Nucl. Acids. Res. 27(15):3168-3172.



Finanzierung

Unsere Arbeiten werden vom Land Hessen, der Deutschen Forschungsgemeinschaft, u. a. im Rahmen des SFB 395, dem Fonds der Chemischen Industrie und der COST Action 841 der Europäischen Gemeinschaft unterstützt.


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